Cheese- and buttermaking Cheese- and buttermaking Сыроделие и маслоделие 2073-4018 91275 10.21603/2073-4018-2024-4-10 Оригинальная статья Original article Оригинальная статья Pichia pastoris Expression System of Recombinant Chymosin of Camelus dromedarius : Selecting Optimal Conditions for Protein Induction Экспрессионная система Pichia pastoris рекомбинантного химозина Camelus dromedarius с подбором оптимальных условий индукции белка Антонова Елена Ивановна Antonova Elena I.

доктор биологических наук;

doctor of sciences in biology;

 Фирсова Наталья Викторовна Firsova Natalya V.

кандидат биологических наук;

candidate of sciences in biology;

 Ленгесова Наталья Анатольевна Lengesova Natalya A.

кандидат биологических наук;

candidate of sciences in biology;

 Викторов Денис Александрович Viktorov Denis A.

кандидат биологических наук;

candidate of sciences in biology;

 Ачилов Атабег Батырович Achilov Atabeg B. Торутанов Павел Сергеевич Torutanov Pavel S. Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова, Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation 27 11 2024 27 11 2024 4 101 110 21 10 2024 11 11 2024 https://cheese.kemsu.ru/en/nauka/article/91275/view

В работе рассмотрена сопряженность между приростом клеточной массы трансформированных P. рastoris/pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT, составом питательных сред и жизнеспособностью штаммов-продуцентов на основе источника углерода и устойчивости к зеоцину, с позиции подбора оптимальных условий для индукции белка химозина. После трансформации P. pastoris GS115/his4 и получения штамма-продуцента P. рastoris/pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT отмечена сопряженность между скоростью прироста клеточной массы и концентрациями зеоцина в среде YPD (не обогащенная глицерином и биотином) и YPD (обогащенная, биотин 0,00004 % и 1 % глицерина). Так, в частности, более динамично увеличивается плотность биомассы при культивировании на «обогащенной» среде, особенно в первые сутки, вне зависимости от концентрации зеоцина. Выявлена разнонаправленная динамика прироста клеточной массы на твердой и жидкой селективной среде. Колонии двух экспериментальных групп, выращенные на твердых селективных средах с дополнительным внесением 200 мкг/мл зеоцина, проявляли рост на третьи сутки культивирования с «обедненной» средой, и на «обогащенной» среде на третьи сутки роста не отмечено. Определена тенденция показателей оптической плотности клеточной массы, выращенной на жидкой селективной среде - после вторых суток на «обогащенной» среде скорость прироста биомассы постепенно снижается, а на «обедненной» среде наоборот, отмечается медленный прирост с увеличением интенсивности после вторых суток. Наращивание клеточной плотности штамма-продуцента P. pastoris GS115/his4 целесообразнее проводить с предварительным внесением 0,5 % метанола в качестве источника углерода и активации метаболического пути MUT (methanol utilization), фермента АОХ, так как в целом штамм GS115/his4 относится к фенотипу Mut+, который характеризуется высоким темпом роста и более высокой производительностью, следовательно, существует необходимость дополнительного внесения метанола. Таким образом полученные данные позволят в практической деятельности оптимизировать цполучение высокопродуктивного штамма-продуцента P. рastoris для дальнейшего высокого выхода рекомбинантного белка

The paper introduces optimal conditions for chymosin protein induction. The research featured the correlation between the cell mass gain of transformed P. pastoris/pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT and the composition of nutrient media with different carbon sources and zeocin resistance producer strains. P. pastoris GS115/his4 was transformed to obtain P. pastoris/pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT as a strain producer. The cell mass growth rate correlated with the zeocin concentrations in the YPD nutrient medium without glycerol and biotin and the YPD nutrient medium fortified with 0.0000% biotin and 1% glycerol. The biomass density increased faster when cultured on the fortified medium, regardless of zeocin concentration, especially during cultivation day 1. The cell mass growth on solid and liquid selective media was multidirectional. The two experimental samples on solid selective media with 200 μg/ml zeocin started growing on cultivation day 3 if the YPD medium was not fortified. The samples on fortified medium, on the contrary, showed no growth on day 3. The optical density of the cell mass grown on liquid selective medium demonstrated a particular pattern: the rate of biomass growth in the fortified medium samples decreased gradually whereas the unfortified medium samples demonstrated signs of growth, which intensified on cultivation day 2. To increase the cell density of P. pastoris strain GS115/his4, a preliminary application of 0.5 % methanol is recommended as a carbon source to activate the MUT metabolic pathway, i.e., methanol utilization. Adding the alternative oxidase enzyme is also recommended since strain GS115/his4 belongs to the MUT+ phenotype with a high growth rate and productivity, hence the need for additional methanol. The obtained data may help to optimize the commercial yield of P. pastoris as a producer of recombinant protein.

 генетическая конструкция рекомбинантный химозин Camelus dromedarius дрожжи Pichia рastoris вектор плазмида зеоцин метанол E. соli genetic construct recombinant chymosin Camelus dromedarius yeast Pichia. pastoris vector plasmid zeocin methanol E. coli Работа написана в рамках выполнения государственного задания «Разработка способа очистки ферментов, как продукта генетически сконструированной экспрессионной системы». Дополнительное соглашение №073-03-2024-060/1 от 13.02.2024 к Соглашению о предоставлении субсидии из федерального бюджета на финансовое обеспечение выполнения государственного задания на оказание государственных услуг (выполнения работ) № 073-03-2024-060 от 18.01.2024, заключенным между ФГБОУ ВО «УлГПУ им. И. Н. Ульянова» и Министерством просвещения Российской Федерации. Регистрационный номер 124102300757-8.

Malik, A. A review on Pichia pastoris: A successful tool for expression of recombinant proteins / A. Malik [et al.] // The Pharma Innovation Journal. 2021. Vol. 10. № 11. P. 550–556. Malik, A. A review on Pichia pastoris: A successful tool for expression of recombinant proteins / A. Malik [et al.] // The Pharma Innovation Journal. 2021. Vol. 10. № 11. P. 550–556. Akishev, Z. Obtaining of recombinant camel chymosin and testing its milk-clotting activity on cow’s, goat’s, ewes’, camel’s and mare’s milk / Z. Akishev [et al.] // Biology. 2022. Vol. 11. № 11. 1545. https://doi.org/10.3390/biology11111545 Akishev, Z. Obtaining of recombinant camel chymosin and testing its milk-clotting activity on cow’s, goat’s, ewes’, camel’s and mare’s milk / Z. Akishev [et al.] // Biology. 2022. Vol. 11. № 11. 1545. https://doi.org/10.3390/biology11111545 Антонова, Е. И. Генетические конструкции как источник получения рекомбинантного химозина / Е. И. Антонова, А. Н. Аббязова, Н. В. Фирсова [и др.] // Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии : Сборник материалов VII Всероссийской научно-практической конференции. Чебоксары: ИД «Среда», 2024. С. 49–55. https://doi.org/10.31483/r-112097; https://www.elibrary.ru/bboeyl Antonova, E. I. Geneticheskie konstrukcii kak istochnik polucheniya rekombinantnogo himozina / E. I. Antonova, A. N. Abbyazova, N. V. Firsova [i dr.] // Fundamental'nye i prikladnye issledovaniya po prioritetnym napravleniyam bioekologii i biotehnologii : Sbornik materialov VII Vserossiyskoy nauchno-prakticheskoy konferencii. Cheboksary: ID «Sreda», 2024. S. 49–55. https://doi.org/10.31483/r-112097; https://www.elibrary.ru/bboeyl Obst, U. A modular toolkit for generating Pichia pastoris secretion libraries / U. Obst, T. K. Lu, V. Sieber // ACS Synthetic Biology. 2017. Vol. 6. № 6. P. 1016–1025. https://doi.org/10.1021/acssynbio.6b00337 Obst, U. A modular toolkit for generating Pichia pastoris secretion libraries / U. Obst, T. K. Lu, V. Sieber // ACS Synthetic Biology. 2017. Vol. 6. № 6. P. 1016–1025. https://doi.org/10.1021/acssynbio.6b00337 Akishev, Z. Constitutive expression of Camelus bactrianus prochymosin B in Pichia pastoris / Z. Akishev [et al.] // Heliyon. 2021. Vol. 7. № 5. e07137. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07137 Akishev, Z. Constitutive expression of Camelus bactrianus prochymosin B in Pichia pastoris / Z. Akishev [et al.] // Heliyon. 2021. Vol. 7. № 5. e07137. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07137 Wang, N. Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris / N. Wang, [et al.] // Protein Expression and Purification. 2015. Vol. 111. P. 75–81. https://doi.org/10.1016/j.pep.2015.03.012 Wang, N. Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris / N. Wang, [et al.] // Protein Expression and Purification. 2015. Vol. 111. P. 75–81. https://doi.org/10.1016/j.pep.2015.03.012 Мурашкин, Д. Е. Анализ некоторых биохимических свойств рекомбинантного химозина сибирской косули (Capreolus pygargus), полученного в культуре клеток млекопитающих (CHO-K1) / Д. Е. Мурашкин, С. В. Беленькая, А. А. Бондарь [и др.] // Биохимия. 2023. Т. 88. №. 9. С. 1556–1569. https://doi.org/10.31857/ S0320972523090087; https://www.elibrary.ru/wwnnwk Murashkin, D. E. Analiz nekotoryh biohimicheskih svoystv rekombinantnogo himozina sibirskoy kosuli (Capreolus pygargus), poluchennogo v kul'ture kletok mlekopitayuschih (CHO-K1) / D. E. Murashkin, S. V. Belen'kaya, A. A. Bondar' [i dr.] // Biohimiya. 2023. T. 88. №. 9. S. 1556–1569. https://doi.org/10.31857/ S0320972523090087; https://www.elibrary.ru/wwnnwk Беленькая, С. В. Разработка продуцента рекомбинантного химозина марала на основе дрожжей Kluyveromyces lactis / С. В. Беленькая, В. В. Ельчанинов, Д. Н. Щербаков // Биотехнология. 2021. Т. 37. № 5. С. 20–27. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-5-20-27; https://www.elibrary.ru/qzyxec Belen'kaya, S. V. Razrabotka producenta rekombinantnogo himozina marala na osnove drozhzhey Kluyveromyces lactis / S. V. Belen'kaya, V. V. El'chaninov, D. N. Scherbakov // Biotehnologiya. 2021. T. 37. № 5. S. 20–27. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-5-20-27; https://www.elibrary.ru/qzyxec Patra, P. Recent advances in systems and synthetic biology approaches for developing novel cell-factories in non-conventional yeasts / P. Patra [et al.] // Biotechnology Advances. 2021. № 47. 107695. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107695 Patra, P. Recent advances in systems and synthetic biology approaches for developing novel cell-factories in non-conventional yeasts / P. Patra [et al.] // Biotechnology Advances. 2021. № 47. 107695. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107695 Küberl, A. High-quality genome sequence of Pichia pastoris CBS7435 / A. Küberl [et al.] // Journal of Biotechnology. 2011. Vol. 154. № 4. P. 312–320. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2011.04.014 Küberl, A. High-quality genome sequence of Pichia pastoris CBS7435 / A. Küberl [et al.] // Journal of Biotechnology. 2011. Vol. 154. № 4. P. 312–320. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2011.04.014 Cereghino, G. P. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris / G. P. Cereghino [et al.] // Current Opinion in Biotechnology. 2002. № 13. P. 329–332. https://doi.org/10.1016/s0958-1669(02)00330-0 Cereghino, G. P. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris / G. P. Cereghino [et al.] // Current Opinion in Biotechnology. 2002. № 13. P. 329–332. https://doi.org/10.1016/s0958-1669(02)00330-0 Inan, M. Non-repressing carbon sources for alcohol oxidase (AOX1) promoter of Pichia pastoris / M. Inan, M. M. Meagher // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2001. Vol. 92. № 6. P. 585–589. https://doi.org/10.1263/jbb.92.585 Inan, M. Non-repressing carbon sources for alcohol oxidase (AOX1) promoter of Pichia pastoris / M. Inan, M. M. Meagher // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2001. Vol. 92. № 6. P. 585–589. https://doi.org/10.1263/jbb.92.585 Sunga, A. J. Posttransformational vector amplification in the yeast Pichia pastoris / A. J. Sunga, I. Tolstorukov, J. M. Cregg // FEMS Yeast Research. 2008. Vol. 8. № 6. P. 870–876. https://doi.org/10.1111/j.1567-1364.2008.00410.x Sunga, A. J. Posttransformational vector amplification in the yeast Pichia pastoris / A. J. Sunga, I. Tolstorukov, J. M. Cregg // FEMS Yeast Research. 2008. Vol. 8. № 6. P. 870–876. https://doi.org/10.1111/j.1567-1364.2008.00410.x Saitua, F. Dynamic genome-scale metabolic modeling of the yeast Pichia pastoris / F. Saitua [et al.] // BMC systems biology. 2017. Vol. 11. 27. https://doi.org/10.1186/s12918-017-0408-2 Saitua, F. Dynamic genome-scale metabolic modeling of the yeast Pichia pastoris / F. Saitua [et al.] // BMC systems biology. 2017. Vol. 11. 27. https://doi.org/10.1186/s12918-017-0408-2 Jungo, C. Mixed feeds of glycerol and methanol can improve the performance of Pichia pastoris cultures: A quantitative study based on concentration gradients in transient continuous cultures / C. Jungo, I. Marison, U. Von Stockar // Journal of Biotechnology. 2007. Vol. 128. № 4. P. 824–837. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2006.12.024 Jungo, C. Mixed feeds of glycerol and methanol can improve the performance of Pichia pastoris cultures: A quantitative study based on concentration gradients in transient continuous cultures / C. Jungo, I. Marison, U. Von Stockar // Journal of Biotechnology. 2007. Vol. 128. № 4. P. 824–837. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2006.12.024 de Lima, P. B. Novel homologous lactate transporter improves l-lactic acid production from glycerol in recombinant strains of Pichia pastoris / P. B. A. de Lima [et al.] // Microbial Cell Factories. 2016. № 15. 158. https://doi.org/10.1186/s12934-016-0557-9 de Lima, P. B. Novel homologous lactate transporter improves l-lactic acid production from glycerol in recombinant strains of Pichia pastoris / P. B. A. de Lima [et al.] // Microbial Cell Factories. 2016. № 15. 158. https://doi.org/10.1186/s12934-016-0557-9