Введение Результаты регулярных массовых обследований различных групп населения Российской Федерации (РФ) показывают широкое распространение дефицита микронутриентов у большей части населения, который приводит к нарушениям сбалансированности питания и снижению адаптационного потенциала человека (Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 14 июня 2013 г. № 31). В Указе Президента РФ № 642 определены приоритетные направления научно-технического развития РФ, среди которых - создание безопасных и качественных продуктов питания, в том числе функциональных. Весьма актуально создание продуктов массового потребления, в частности хлебобулочных изделий (ХБИ), особенно хлеба адаптогенного действия с добавлением биологически активных веществ (БАВ) адаптогенов - веществ, способных повышать неспецифическую сопротивляемость организма человека к широкому спектру вредных стрессорных воздействий физической, химической и биологической природы, то есть обладающих общим стресспрофилактическим действием. Авторами разработана линейка хлебобулочных изделий с добавлением ингредиентов - БАВ на основе водных биологических и растительных ресурсов Дальнего Востока, обладающих доказанным общим стресспрофилактическим действием [1]. В проведенных доклинических исследованиях авторами показано, что созданные хлебобулочные изделия обладают общими стресспрофилактическими свойствами [2]. Стресспрофилактическое действие БАВ и продуктов на их основе является комплексным, часть которого обусловлена противоязвенной активностью компонентов. В литературе представлено большое количество сообщений, демонстрирующих связь между стрессом и развитием различных заболеваний, в том числе язвы желудочно-кишечного тракта [3-5]. Объекты и методы исследования Целью представленной работы является изучение стресспрофилактического, в том числе противоязвенного, действия разработанных видов хлеба из пшеничной муки высшего сорта с добавлением новых ингредиентов на основе сырья Дальнего Востока в экспериментах на животных. Объектами исследования явились ХБИ, разработанные по рецептуре авторов, с добавлением водно-этанольных экстрактов (далее по тексту - экстрактов) на основе водных биологических (БАД Фуколам®, водно-этанольного экстракта Фуколам-Э) и растительных ресурсов (водно-этанольных экстрактов калины, лимонника, винограда) Дальнего Востока. Выбор добавляемых в хлеб ингредиентов был обусловлен их химическим составом, доказанным общим стрес- спрофилактическим действием в составе хлеба и других продуктов питания, ожидаемым позитивным гастропротекторным действием [6]. БАД к пище Фуколам® и водно-этанольный экстракт Фуколам-Э разработаны учеными Тихоокеанского института биоорганической химии (ТИБОХ) ДВО РАН на основе водных биологических ресурсов. Фуколам® является источником полисахаридов (фукоидана) и растворимых пищевых волокон, полученных из морских бурых водорослей Fucus evanescens [7]. Разрешены к применению, включены в Федеральный реестр биологически активных добавок к пище. Фукоидан - сульфатированный полисахарид, обладающий выраженной разносторонней биологической активностью, аргументированной с позиций доказательной медицины. В состав побочного продукта производства Фуколам® - водно-этанольного экстракта Фуколам-Э [8] входят вещества белковой природы, тирозин, фенилаланин, полифенольные соединения; минеральные и липофильные вещества, обладающие полезными для организма человека свойствами [9-10]. БАД к пище Калифен®, Экликит® и Диприм® разработаны учеными Тихоокеанского океанологического института (ТОИ) ДВО РАН и представляют собой водно-этанольные экстракты, полученные из отходов переработки калины, лимонника китайского и винограда амурского. Разрешены к применению, включены в Федеральный реестр биологически активных добавок к пище. Экликит® - водно-этанольный экстракт лимонника китайского (Schizandra chinensis), темно-малинового цвета со специфическим запахом и сладковато- кисловатым вкусом, выделен из гребней (осевая часть соцветия, освобожденная от ягод) (свидетельство на товарный знак № 217230 и № 222515) [11]. Калифен® - водно-этанольный экстракт калины, темно- коричневого цвета с приятным специфическим запахом и сладковато-кисловато-терпким вкусом. Выделен из побочных продуктов, полученных в процессе производства сока калины (Vibrurnum L.) (свидетельство на товарный знак № 228327 и № 225516) [12]. Диприм® - водно-этанольный экстракт, получен из гребней дикорастущего амурского винограда (Vitis Аmurensis) (свидетельство на товарный знак № 1907216) [13]. Основным компонентом экстрактов являются БАВ, среди которых растительные полифенолы, составляющие в них свыше 60 % сухого остатка. Кроме полифенольных соединений в экстрактах представлены: катехины, лейкоантоцианы, флавоноиды, процианидины, олигомерные танины и лигнин; органические кислоты, свободные аминокислоты, сахара и ряд других органических соединений. В трудах авторов БАД к пище и других ученых показано, что разработанные продукты питания (напитки, кондитерские изделия и т. п.) с добавлением вышеперечисленных экстрактов обладают многофакторным положительным действием на организм человека, в том числе общим стресспрофилактическим и адаптогенным [14-16]. В условиях производства инновационно- технологического центра ДВФУ были выработаны опытные образцы хлеба из пшеничной муки с добавлением экстрактов, которые вносили в тесто в определенных количествах по рецептуре разработанных ранее хлебобулочных изделий. Все применяемые в ходе работ объекты и сырье соответствовали действующей в РФ и Евразийском экономическом союзе нормативной документации. Исследования проводили в лабораториях Школы биомедицины и Школы экономики и менеджмента Дальневосточного федерального университета. Экспериментальные работы или доклинические исследования проводили совместно с сотрудниками кафедры фармации Тихоокеанского государствен- ного медицинского университета (ТГМУ), на работу получено разрешение Этического комитета ТГМУ. Стресспрофилактическое и противоязвенное действие разработанных видов хлеба изучали на модели нейрогенного повреждения слизистой оболочки желудка (так называемой стресс-язвы) у экспериментальных животных. Стресс - общий адаптационный синдром, при котором уже на ранних стадиях стрессовой реакции возникают изменения массы иммунокомпетентных органов-мишеней (надпочечник, тимус, селезенка), свидетельствующие о нарушении метаболических процессов. Показателем стрессированности при экстремальном воздействии является также появление язвенных поражений слизистых оболочек желудка. Нормализация такой постстрессовой морфологической картины в организме животных при длительном воздействии разработанных продуктов питания (препятствие изменению массы иммунокомпетентных органов-мишеней, снижение количества язв в желудке) является показателем эффективности их действия. Для выражения интегральной степени стрессированности организма и ее коррекции одним показателем в работе использовали шестибалльную шкалу, предложенную Ю. И. Добряковым (от 0 до 5) (табл. 1). Препарат считается активным и стресспрофилактическим, если разница балльной оценки в контрольной и подопытной группах превышает 2 балла. Исследования выполнены на беспородных мышах и крысах линии Август, полученных из питомника Российской академии наук (РАН) «Столбовая», содержащихся на стандартном пищевом рационе в условиях вивария. Работа выполнена с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes Strasbourg, 18.03.1986) и «Правил проведения работ с использованием эксперимен- тальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755). Таблица 1 - Балльная оценка стрессированности организма [17] Table 1 - Organism stress level score [17] Показатель Масса органа, % к норме Балл 0 1 2 3 4 5 Надпочечник ≤ 100 101-112 113-125 126-137 138-149 ≥ 150 Тимус ≥ 100 99-87 86-74 73-61 60-51 ≤ 50 Селезенка ≥ 100 99-87 86-74 73-61 60-51 ≤ 50 Количество изъязвлений 0 0-0,9 1,0-1,9 2,0-2,9 3,0-4,0 > 4 Таблица 2 - Показатели стрессированности мышей («вынужденное плавание») по Ю. И. Добрякову после приема хлеба с добавлением Фуколама-Э на протяжении 25 дней до стресса (M ± m) Table 2 - Mice stress level indicators (induced swimming) according to Yu. I. Dobryakov after the intake of bread containing Fukolam-E for 25 days before exposure to stress (M ± m) Группы животных Надпочечник Тимус Селезенка Язвы желудка сумма баллов масса, мг/г массы тела % балл масса, мг/г массы тела % балл масса, мг/г массы тела % балл шт. балл Интактные 0,08 ± 0,006 100 0 1,3 ± 0,2 100 0 3,6 ± 0,5 100 0 0 0 0 Контрольные 0,18 ± 0,01 225 5 0,69 ± 0,0 53 4 3,0 ± 0,5 83 2 6 5 16 Опытные 0,13 ± 0,01 162 5 1,2 ± 0,1 92 1 3,3 ± 0,4 92 1 4 5 12 0 3 1 0 4 В ходе исследования были выделены следующие группы животных (по семь особей в каждой группе): группа интактных животных, не получавших стресс и находившихся на стандартной диете; пять групп опытных животных, получавших стресс по выбранной экспериментальной модели, в рацион которых на протяжении 25 дней входил хлеб с добавлением экстрактов; пять групп контрольных животных, получавших стресс по выбранной экспери- ментальной модели, в рацион которых на протяжении 25 дней входил хлеб из той же партии выпечки, которую получали опытные животные, но без экстрактов. На время приема хлеба с экстрактом каждое животное отсаживали в отдельную клетку, где они потребляли хлеб с добавкой, рассчитанный на конкретную массу мыши или крысы. После поедания хлеба с добавкой животные возвращались в клетки, где они получали обычный суточный рацион. Расчет потребляемого животными хлеба проводили с учетом их веса. В основу расчета была положена суточная потребность в хлебе взрослого человека со средним весом 70 кг - 300 г в сутки. Стресс у животных моделировали стандартным экспериментальным методом «вынужденное плавание», с учетом методических указаний «Пищевые продукты и пищевые добавки. Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище» [18]. После экспериментального стресс-воздействия животных выводили из опыта, подсчитывали относительную массу органов-мишеней (надпочечник, тимус, селезенка) в процентах к норме и количество язв на слизистой оболочке желудка с использованием бинокулярной лупы. Результаты и их обсуждение Результаты оценки стрессированности мышей, получающих хлеб с БАД на основе гидробионтов, представлены в табл. 2 и 3. В табл. 2 показаны результаты оценки стрессированности мышей после введения им в рацион хлеба с водно-этанольным экстрактом бурых водорослей Фуколам-Э на протяжении 25 дней до стресса, в сравнении с другими группами. Изменение массы органов мишеней представлено в виде суммы баллов. Язвенные деформации представлены в виде количества язв и в виде суммы баллов. Как показывают полученные данные, разница в баллах, оценивающих общую или интегральную степень стрессированности животных, между контрольной и опытной группами составила 4 балла, что говорит о защитном действии хлеба с добавлением водно-этанольного экстракта Фуколам-Э. Уровень стрессированности органов- мишеней животных, получавших хлеб с Фуколамом-Э, был в 1,5 раза меньше, чем у таковых контрольной группы. Несмотря на одинаковое количество баллов по язвам желудка, число язв в желудке мышей опытной группы было также меньше в 1,5 раза или на 2 язвы меньше, чем в желудке животных контрольной группы. В табл. 3 показаны результаты оценки стрессированности мышей после введения им в рацион хлеба с Фуколамом® на протяжении 25 дней до стресса, в сравнении с другими группами. Таблица 3 - Показатели стрессированности мышей («вынужденное плавание») по Ю. И. Добрякову после приема хлеба с добавлением Фуколама® на протяжении 25 дней до стресса (M ± m) Table 3 - Mice stress level indicators (induced swimming) according to Yu.I. Dobryakov after the intake of bread containing Fukolam® for 25 days before exposure to stress (M ± m) Группы животных Надпочечник Тимус Селезенка Язвы желудка Сумма баллов масса % балл масса % балл масса % балл шт. балл Интактные 0,07 ± 0,006 100 0 2,4 ± 0,2 100 0 5,2 ± 0,5 100 0 0 0 0 Контроль 0,14 ± 0,01 200 5 1,2 ± 0,0 50 5 4,6 ± 0,5 88 1 10 5 16 Опытные 0,11 ± 0,01 157 5 1,9 ± 0,1 79 2 4,2 ± 0,4 81 2 4 4 13 Таблица 4 - Показатели стрессированности крыс («вынужденное плавание») по Ю. И. Добрякову после приема хлеба с добавлением водно-этанольных экстрактов на основе растительного сырья Дальнего Востока (M  m) Table 4 - Rats stress level indicators (induced swimming) according to Yu. I. Dobryakov after the intake of bread containing aqueous and ethanolic extracts from Far East plant sources (M ± m) Группы животных Надпочечник Тимус Селезенка Язвы желудка Сумма баллов масса, мг/г массы тела % балл масса, мг/г массы тела % балл масса мг/г массы тела % балл шт. балл Интактные 0,11 ± 0,006 100 0 2,3 ± 0,2 100 0 4,6 ± 0,5 100 0 0 0 0 Контроль 0,21 ± 0,01 90 5 0,8 ± 0,06 35 5 3,0 ± 0,5 65 3 7 5 18 Опытные, получавшие хлеб с Дипримом® 0,15 ± 0,01 36 3 1,5 ± 0,1 65 3 3,3 ± 0,4 72 3 4 5 14 Опытные, получавшие хлеб с Экликитом® 0,18 ± 0,02 64 5 1,2 ± 0,1 52 4 3,2 ± 0,3 70 3 3 4 16 Опытные, получавшие хлеб с Калифеном® 0,16 ± 0,02 45 4 1,7 ± 0,2 74 2 3,9 ± 0,4 85 2 5 5 13 Как показывают полученные данные, разница в баллах, оценивающих общую степень стрессированности животных, между контрольной и опытной группами составила 3 балла, что говорит об общем стресспрофилактическом действии хлеба с добавлением водно-этанольного экстракта Фуколам-Э, но несколько менее выраженном (на 1 балл), чем у хлеба с Фуколамом®. Однако противоязвенное действие Фуколама-Э было более действенным в группе мышей, получавших Фуколам-Э и подвергшихся стрессу - язв в желудке было в 2,5 раза или на 6 язв меньше, чем у мышей в контрольной группе. Данные по стресспрофилактическому действию хлеба с водно-этанольными экстрактами на основе растительного сырья представлены в табл. 4. Наилучшие результаты общей стрессоустойчивости показали животные, получавшие хлеб (в порядке убывания активности) с Калифеном®, Дипримом®, Экликитом®. У крыс, получающих хлеб с экстрактом калины, разница в интегральном показателе - баллах между этой группой и контрольной, получающей хлеб без экстракта, равна 5. Немного меньше (4 балла) была разница между животными с рационом, включающим хлеб с Дипримом®, и контрольной группой. Уровень стрессоустойчивости у животных, получающих Экликит®, практически не отличался от такового у крыс контрольной группы (18 и 16 баллов соответственно), разница составила только 2 балла. Однако общая стресспрофилактическая активность у всех видов животных, получающих хлеб с растительными экстрактами, не была сопряженной с их противоязвенной активностью. Лучшие результаты противоязвенной активности показали животные, получавшие хлеб (в порядке убывания активности) с Калифеном®, Дипримом®, Экликитом®. У крыс, получающих Экликит® (лимонник) и показавших минимальную общую стрессоустойчивость по сравнению с контрольной группой животных - 2 балла, (16 и 18 баллов соответственно), язв было в 2,3 раза меньше, чем в контрольной группе (3 и 7 соответственно). Крысы, получавшие хлеб с калиной и показавшие максимальную стрессоустойчивость (5 баллов), имели в желудке 5 язв, что только на две меньше, чем у животных контрольных групп. Промежуточное положение занимали животные, употребляющие хлеб с Дипримом® (4 и 7 язв соответственно). Показатель стрессированности, баллы 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Интактные Контрольные Опытные Разница «К-О» Группа экспериментальных животных Фуколам-Э Фуколам® Диприм® Экликит® Калифен® Рисунок 1 - Показатели стрессированности в баллах органов-мишеней животных, получающих в стандартном пищевом рационе хлеб с добавками экстрактов растительного сырья, БАД к пище и экстрактов растительных гидробионтов. «К - О» (К - 0, контроль - опыт соответственно) - разница баллов, характеризующих стрессоустойчивость Figure 1 - Stress level indicators scores for target organs of the animals that got bread with additives containing plant extracts as a part of standard dietary intake, biologically active food supplements and extracts from the plant aquatic organisms. “К - О” (К-0, control - experiment, respectively), difference in scores characterizing resisrance to stress Группа экспериментальных животных Разница «К-О» Опытные Контрольные Интактные 0 2 4 6 Калифен® Экликит® Диприм® Фуколам® Фуколам-Э Показатель стрессированности, баллы 4 балла; действие хлеба с Фуколамом® было оценено на 3 балла; хлеб с Экликитом® не показал хороших результатов по стрессоустойчивости у экспериментальных животных, разница составила только 2 балла. Таким образом, данные проведенного исследования показали, что введение в рацион питания экспериментальных животных хлеба с водно-этанольными экстрактами на основе растительного и водного сырья Дальнего Востока профилактически, на протяжении 25 дней до стресса, способствует повышению их стресспрофилактической, в том числе противоязвенной активности, в большей степени, чем у животных контрольных групп, получающих такой же хлеб, но без добавок. При сравнении стресспрофилактического действия хлеба с тремя экстрактами растительного происхождения и двумя водными экстрактами по Рисунок 2 - Показатели стрессированности в баллах (противоязвенное действие) у животных, получающих в стандартном пищевом рационе хлеб с добавками экстрактов растительного сырья, БАД к пище и экстрактов морских водорослей. «К - О» (К - 0, контроль - опыт соответственно) - разница баллов, характеризующих стрессоустойчивость Figure 2 - Stress level indicators scores (antiulcer activity) of the animals that got bread with additives containing plant extracts as a part of standard dietary intake, biologically active food supplements and extracts from the seaweed. “К - О” (К-0, control - experiment, respectively), difference in scores characterizing resisrance to stress устойчивость перед экспериментально вызванным стрессом. При сравнении На рис. 1 и 2 представлены обобщенные данные, показывающие, что введение в рацион животных хлеба с добавлением водно-этанольных экстрактов на основе растений, БАД к пище и водно-этанольных экстрактов морских водорослей Дальнего Востока повышает их стресспрофилактического действия хлеба с тремя экстрактами растительного происхождения и двумя водными экстрактами по общему количеству интегрального показателя - разницы баллов, характеризующих стрессоустойчивость (К - 0, контроль - опыт соответственно) - зафиксированы следующие данные: лучшие показатели были у хлеба с Калифеном® - 5 баллов; с Дипримом® и Фуколамом-Э - общему количеству интегрального показателя, лучшие показатели были у хлеба с растительными добавками калины - Калифен®; эффективность хлеба с Дипримом (экстракт косточек винограда) и Фуколамом-Э (водно-этанольный экстракт бурых водорослей) была несколько ниже. Стресспрофилактическое действие хлеба с БАД Фуколам® было минимальным, хлеб с БАД Экликит® не показал хороших результатов по стрессоустойчивости у экспериментальных животных. При этом общее положительное стресспрофилактическое и противоязвенное действие разработанных видов хлеба с экстрактами не всегда было однонаправленным, также как и морфологическая картина стрессовых органов-мишеней, что обусловлено различием химического состава экстрактов и разнообразием механизмов их действия. Полученные результаты показывают целесообразность представления разработанных видов хлеба в качестве стресспрофилактических и противоязвенных продуктов питания, а также возможность рекомендовать их применение категориям лиц, находящимся в экстремальных ситуациях. Работа поддержана Российским научным фондом (проект №14-50-00034).